趣天学塘 QTXT

首先要确定是要做瞬时转染还是稳定转染？

若为瞬时转染，就是一次性转染完毕后检测分析目标的基因表达或者蛋白．

若为稳定转染，应先判断是用质粒进行转染还是用慢病毒进行转染。如果选择质粒，就得根据你用的质粒选择筛选药物，做药物筛选浓度就得两个礼拜左右（在做转染之前应先确定最佳筛选浓度）。转染后，将转染的细胞进行药物筛选，挑选出单克隆细胞群．再分个在９６孔板，然后继续扩增培养．

.下面为有关脂质体2000转染的资料：

LIPOFECTAMINE 2000 转染 293 细胞方案

1) 转染前一天用胰蛋白酶消化下细胞并重新计数，以每孔2 x 105的密度接种于24孔的培养板中，每孔加入0.5ml的含血清的正常生长培养液（不能含有抗生素）。细胞在转染那天应该能够达到90-95%的融合。在细胞密度较高时进行转染可以取得最好的效果。

2) 对于要转染的每孔细胞，用50ul的OPTI-MEM低血清培养基（或其他的无血清培养基）来稀释0.8ug的DNA。

3) 对于要转染的每孔细胞，用50ul的OPTI-MEM低血清培养基来稀释2ul LIPOFECTAMINE 2000，并在室温下孵育5分钟。一旦LIPOFECTAMINE 2000稀释完成后，30分钟内必须和DNA溶液混合孵育。更长时间的孵育会导致活性的降低。对于多孔的细胞稀释可以在较大的容器里一次完成。

注意：如果用DMEM作为LF2000的稀释溶剂，那么5分钟内必须和稀释了的DNA溶液混合。

4) 将稀释了的DNA（来自步骤二）和稀释了的LF2000（来自步骤三）混合，在室温下孵育20分钟促使DNA-LF2000混合物的形成。

5) 直接往每孔中加入DNA-LF2000混合物100ul，并轻轻前后晃动培养板使其混匀。

6) 在37℃的CO2 孵箱中孵育细胞24小时可以检测转基因的表达。其间没有必要移去混合物或是更换培养基。如有必要可以在孵育后的4-6小时内更换培养基，那样不会降低转染活性。

稳定表达株用瞬时转染加压力筛选已经不是很流行了。现在多用比较安全的逆转录病毒将基因负载并感染宿主细胞，整合进宿主细胞基因组，能够永久表达目的基因。

做了一段时间的稳定转染，觉得用脂质体的方法要慎重。

1、对于有的细胞系来说，脂质体非常难转染，转染效率很低。对于Hep-2(喉癌细胞系)，多查查文献。建议不要过多参考国内文献，有时会把你的时间忽悠过去。

2、即使转染效率比较高，也筛选出稳定转染的细胞株了，但维持的时间也不会很长，教材上好像说几个月，有待查证。质粒在细胞传代过程中会丢失。

3、建议能用瞬时转染完成试验的，就用瞬时。对于不太好转染的细胞系，推荐用病毒转染。我没有用病毒转染过，但据其说明和做过的人说，效率可以得到保证。

我曾做过几个月的转染和筛选，查过一点儿资料，一起讨论一下。

质粒转染入细胞后，在细胞质中。在细胞生长传代过程中，这些质粒会被大约是排异一样的机制消灭。极少部分的质粒进入细胞核（非常小概率的小概率事件），和DNA整合，整合的位置不一致，质粒表达的效应也不一致。所以会存在筛选出的稳定株，质粒效应上差异很大。

记不清楚在什么地方查到的，不过我觉得上述看法值得商榷，我觉得筛选出的稳定株中的质粒所处的位置也应该在细胞株中，所谓的稳定株，应该是这些细胞的排异质粒机制差一点儿，所以质粒可以在细胞质中存在的时间更长一些。但因为在细胞质中，所以在一定时间后，又会被细胞排异，稳定株并不能真的永久稳定下来。

转染后的细胞，用G418长期维持，可以筛选出耐G418的细胞株。这种细胞株有的可能是转染质粒后形成抗性的细胞株，有的可能是少部分细胞突变产生耐G418.我曾用G418维持转染荧光质粒的稳定株细胞，一段时间后，看不到荧光，但在G418加压下细胞生长还很不错呢。

质粒和病毒在基因载体用途中的区别不仅仅在于两点：转染效率和是否整合（也即是否长期表达）。质粒瞬时转染的效率目前最好的办法lipofectin2000也仅仅70左右，极少数情况也有90％的，但是造价也不低。而且转染了之后要想获得稳定的表达株就必须要抗性筛选。而病毒感染效率一般都在90％以上。如果是逆转录病毒（尤其慢病毒）一旦感染就一定整合，也即能够长期表达（最少2年以上）

5KB完全能够被病毒载体负载。慢病毒能够负载9KB左右。

稳转后筛选要注意细胞的密度，密度低了全筛死了，高了阴性株占优势了吧你的阳性克隆会盖下去。这个是要注意的。还有你的筛选药预先致死量实验，摸好浓度。

转染前最好选择有标记的比如EGFP的质粒这样方便观察。

推荐一个方法：筛一段时间后，镜下观察阳性克隆位置直接挑出进行克隆，这样比较快，纯一点。

另外，lipo2000转染不能完全按照说明书做，要自己摸条件，比如细胞数量和密度，转染试剂用量，时间，培养等。